В молекуле субстрата могут быть положительно и отрицательно заряженные группы, поляризованные группы с частичными зарядами, а также гидрофобные зоны. Соответственно, в субстрат-связывающем участке активного центра напротив положительно заряженных групп субстрата будут располагаться отрицательно заряженные группы фермента, напротив отрицательно заряженных – положительно заряженные, а напротив гидрофобных фрагментов субстрата – гидрофобные аминокислотные остатки. Таким образом, связывание фермента с субстратом происходит благодаря ионным, водородным и гидрофобным взаимодействиям.

В настоящее время детально изучен механизм работы далеко не всех ферментов. Одним из наиболее изученных является фермент поджелудочной железы α-химотрипсин, расщепляющий белки пищи в двенадцатиперстной кишке и тонком кишечнике. Он гидролизует пептидные связи, расположенные около ароматических аминокислот субстрата. В каталитическом участке активного центра α-химотрипсина находятся три аминокислотных остатка: серин, гистидин и аспарагиновая кислота. В третичной структуре фермента они тесно прилегают друг другу, но в первичной структуре расположены далеко: гистидин является 57-й аминокислотой с N-конца, аспартат – 102-й, серин – 195-й.

В начале процесса катализа в активный центр фермента заходит субстрат, для нас важна одна-единственная пептидная связь в его молекуле (этап 1 на рисунке). Появление субстрата вызывает перемещение иона Н+ от серина на гистидин, а образовавшийся анион серина немедленно атакует карбонильный атом углерода в пептидной связи субстрата (этап 2 на рисунке). Образуется очень короткоживущее промежуточное соединение, в котором атом углерода субстрата связан с двумя атомами кислорода, одним атомом азота и одни атомом углерода. Это соединение быстро распадается, причем одна его половинка остается ковалентно связанной с остатком серина, а другая забирает ион Н+ от гистидина и становится полностью свободной (этап 3 на рисунке). Такое ковалентное соединение фермента с частью субстрата называется ацил-фермент. Затем часть субстрата со свободной аминогруппой уходит из активного центра (этап 4 на рисунке). Для завершения реакции необходимо гидролизовать ацил-фермент, и в активный центр химотрипсина приходит молекула воды (этап 5 на рисунке). Опять образуется короткоживущий промежуточный комплекс, в котором атом углерода субстрата связан с тремя атомами кислорода и одни атомом углерода (этап 6 на рисунке). Этот комплекс также быстро распадается, при этом ковалентная связь между остатком субстрата и фермента разрывается (этап 7 на рисунке). Наконец, остаток субстрата покидает активный центр фермента, и он возвращается в исходное состояние (этап 8 на рисунке). В результате реакция гидролиза пептидной связи протекает через множество промежуточных этапов. Без фермента реакция идет очень медленно, а каждая из промежуточных стадий, протекающих в активном центре фермента, идет быстро, в итоге фермент резко ускоряет протекание реакции.

Скорость химической реакции – это изменение концентрации продукта в единицу времени. Еще в 1913 году Михаелис и Ментен вывели уравнение зависимости скорости простейшей ферментативной реакции S → P от концентрации субстрата. Чтобы лучше понять биохимическую основу этого математического уравнения, представим себе условия протекания ферментативной реакции, когда субстрата очень мало. Большинство молекул фермента при этом не связано с субстратом, они "бродят без работы", и скорость реакции мала. Если повышать концентрацию субстрата, то скорость реакции растет почти линейно. Но бесконечно скорость реакции повышаться не может: при очень большой концентрации субстрата все молекулы фермента окажутся связаны с ним – весь фермент перейдет в фермент-субстратный комплекс. Скорость реакции уже не будет расти при повышении концентрации, и кривая скорости будет стремиться к асимптоте. Математически это уравнение выглядит так: