Метод определения фосфат-иона основан на образовании окрашенного комплексного соединения между фосфором, молибдатом аммония и малахитовым зеленым в сильно кислой среде. Количество фосфора рассчитывают по результатам измерения поглощения образующегося комплексного соединения при длине волны 645 нм на фотоколориметре.

Содержание соединений с С-Р связью определяют по разнице между количеством общего и неорганического фосфора. Концентрацию фосфора общего определяют на спектрофотометре по образованию комплекса фосфомолибдата с малахитовым зеленым при низких значениях рН после гидролиза с персульфатом аммония, в ходе которого происходит разрыв С-Р связи и высвобождение фосфат-иона. Соотношение предварительно разведенной культуральной жидкости и персульфата аммония было 1:1.

Пробы культуральной жидкости отбирали в эппендорфы для анализа, центрифугировали 10 тыс. об./мин - 2 мин, супернатант хранили в замороженном виде для разрыва С-Р связи ГФ в стеклянных пробирках проводили гидролиз проб с персульфатом аммония. Для приготовления раствора персульфата 8 г персульфата аммония растворяли в 20 мл дистиллированной Н2О. Смешивали пробу и раствор персульфата аммония в соотношении 1:1 в стеклянных пробирках, которые закрывали фольгой и закрепляли ее резиновыми кольцами. Гидролиз проводили в течение 60 мин. при 900C на водяной бане.

Вносили в эппендорфы компоненты реакции в соотношении: 130 мкл 1н H2SO4-, 130 мкл пробы, 1300 мкл раствора С. Смесь тщательно перемешивали. Через 10-15 минут измеряли ОП при длине волны 645 нм (ОП645) в кювете 1 см, в линейной области значений ОП от 0,2 до 0,5. В качестве контроля использовали образец культуральной жидкости без добавления персульфата аммония.

Приготовление растворов:

Раствор А: 90 мг малахитового зеленого растворяли в 200 мл дистилированной воды при перемешивании в течение 30 мин. на магнитной мешалке;

Раствор В: 8,4 г молибдата аммония растворяли в 60 мл HСl конц в течение 20 мин. при перемешивании стеклянной палочкой; после растворения молибдата аммония в HCl конц. добавляли полученный раствор к 138 мл дистиллированной Н2О.

Раствор С: смешивали по 200 мл растворов А и В, перемешивали в пластиковой емкости на магнитной мешалке в течение 30 мин., фильтровали полученный раствор С через плотный бумажный фильтр в пластиковую посуду. Раствор С использовали для анализа. Хранили в холодильнике, в течение надели. Перед каждым употреблением фильтровали через бумажный фильтр.